Цепная реакция. как работают тесты на коронавирус?

О точности диагностики

В России одобрены к использованию десятки тест-систем для выявления коронавируса. Ключевые характеристики — диагностические специфичность (точность) и чувствительность. Первый параметр показывает способность набора определить конкретный вирус. Второй — возможность обнаружить его части, даже если в биоматериале их очень мало. «Чем эти параметры ближе к ста процентам, тем лучше», — подчеркивает Тамара Силкина.

«Порог чувствительности — общий как для российских, так и для зарубежных тестов: 10³ на миллилитр. То есть должно быть не менее тысячи вирусных геном-эквивалентов на миллилитр образца. «ДНК-технология» заявила о чувствительности 10¹ — десять вирусных единиц на миллилитр. Другой важный показатель — воспроизводимость, то есть возможность получить одинаковый результат в разных условиях. Нужно учитывать и сходимость — отсутствие существенных различий между измерениями, выполненными в одинаковых условиях», — добавляет медик.

Метод ПЦР с обратной транскрипцией хорошо отработан и практически полностью автоматизирован. С момента попадания в лабораторию анализ занимает четыре-шесть часов. В мире эти тесты буквально поставили на поток. Только в Москве, по официальным данным, сделали 12 миллионов анализов.

Поскольку этот метод прямо выявляет возбудителя в организме, его относят к доказательной медицине и рекомендуют учитывать в клинической практике. Однако анализ больших данных говорит, что при массовом использовании ПЦР-тесты часто промахиваются.

Ложнонегативные результаты получаются в 20-66 процентах случаев. Такие данные из литературы приводят исследователи из Сеченовского университета. Вместе с зарубежными коллегами они изучили записи пациентов, госпитализированных в университетскую клинику в апреле — мае. Из 3480 человек, чьи ПЦР-тесты были доступны, примерно половина оказались чистыми. В то же время клиническая картина и КТ легких указывали на коронавирусную инфекцию. Авторы допускают, что в реальной клинической практике ПЦР-анализ не столь и критичен.

«Этиологическая диагностика, которая выявляет причину заболевания, нужна априори, — не соглашается Айрат Мавзютов, заведующий кафедрой фундаментальной и прикладной микробиологии, профессор кафедры лабораторной диагностики Башкирского государственного медицинского университета, руководитель Исследовательского центра «Лаборатория». — При вирусных инфекциях других, сравнимых по чувствительности и специфичности (точности), методов, кроме ПЦР-тестирования, нет».

Важно понимать, объясняет профессор Мавзютов, что клинический диагноз опирается на субъективные данные — анамнез (опрос) и осмотр пациента. На их основании невозможно установить вирусную природу заболевания и тем более какой именно возбудитель его вызвал

Для этого проводятся лабораторные исследования. Получаемые при этом данные, продолжает ученый, намного объективнее, поскольку большинство современных методов лабораторных исследований автоматизировано. Соответственно, на результаты не повлияют случайные факторы: уровень подготовки специалистов, их настроение, «погода в доме» и так далее.

«Диагноз COVID-19 можно поставить, только когда в материале от больного обнаружили РНК вируса SARS CoV-2 методом ПЦР или же антигены этого вируса иммунохимическими методами. Не выявив следов вируса в организме, нельзя говорить о «ковидной» природе заболевания или летального исхода», — утверждает Айрат Мавзютов.

Он обращает внимание на еще один аспект. ПЦР-тест не отличает РНК вируса, способного к репродукции, то есть размножению, от обломков «нежизнеспособных» вирусных частиц

Он лишь позволяет понять, присутствует или нет РНК коронавируса в клетках.

«Пока инфицированные клетки не заменятся на новые, а на это уходит от двух до четырех недель, не исключены положительные результаты. При этом вирус может быть уже «мертвым», человек здоров и никому не опасен», — отмечает профессор. Для уточнения учитываются данные целого ряда дополнительных исследований, позволяющих на лабораторном уровне оценивать остроту воспалительного процесса или образование антител на стадии его завершения.

Тест на антитела (серологический)

• Положительный тест на антитела указывает на перенесенную ранее инфекцию SARS-CoV-2. Это может означать, что пациент устойчив к вирусу и больше не будет заражен. Однако SARS-CoV-2 является новым патогеном, и до сих пор неясно, обеспечивает ли предыдущая инфекция иммунитет, и если да, то как долго.
• Отрицательный результат теста означает, что иммунная система не продуцировала антитела против инфекции, то есть испытуемый не имел инфекции SARS-CoV-2. Однако результат также может быть отрицательным, если тест был проведен слишком рано после заражения, когда количество антител в организме еще не обнаружено. 

Согласно CDC, уровень антител может быть определен в течение 1-2 недель после того, как пациент заболел, хотя в некоторых случаях для выработки антител может потребоваться больше времени.

Мазки на коронавирус

Метод петлевой изотермической амплификации, LAMP

Метод петлевой изотермической амплификации, LAMP (от англ.Loop-mediated isothermal amplification) считается упрощенной ПЦР. Производители тест-систем обещают точность метода до 94%.

Во многом метод LAMP схож с ПЦР, за исключением ряда нюансов: праймеров требуется больше, амплификаторов (приборов, периодически изменяющих температуру) не требуется вовсе, как не требуется и электрофореза. РНК вируса также достраивается до ДНК, а дальше копирование идет при постоянной температуре и занимает всего 20-30 минут.

Чтобы увидеть результат, не требуется электрофорез, достаточно просто взглянуть на пробирку. Мутный осадок говорит о том, что в образце обнаружен вирус. Осадок частично состоит из ионов, освобождающихся из «букв»-нуклеотидов во время синтеза ДНК. Если он появляется, значит, ДНК вируса удалось размножить. Многие производители добавляют в свои тест-системы флуоресцентные красители ДНК, чтобы наличие или отсутствие вирусной частицы не вызывало сомнений.

Reuters

Особенности профилактики, диагностики и лечения КОВИД-19

Мировые правительства работают над созданием контрмер, чтобы остановить разрушительные последствия. Специалистами было подсчитано, что своевременно введенные строгие ограничения могли спасти 3 млн жизней в 11 европейских странах. 

Медицинские организации координируют информационные потоки и регулярно издают директивы и руководства для максимального смягчения воздействия угрозы. В то же время ученые всего мира работают не покладая рук, благодаря чему информация о механизмах передачи, клиническом спектре болезней, новых диагностических средствах, а также стратегиях профилактики и лечения быстро развивается. 

Но до сих пор остается много неясностей как в отношении взаимодействия вируса с хозяином, так и в отношении развития пандемии, особенно в отношении времени, когда она достигнет своего пика.

Предполагаемый репродуктивный цикл 2019-nCoV

На данный момент терапевтические стратегии по борьбе с этой инфекцией носят только поддерживающий характер. Поэтому лучшее оружие – профилактика снижения передачи инфекции в обществе. Пример – агрессивные меры в Китае, обеспечившие постепенное сокращение случаев инфицирования. 

Из Китая болезнь распространилась на Европу. В Италии, болезнь сначала атаковала географические регионы на севере, а затем и весь полуостров. Политические органы и медики приложили невероятные усилия, чтобы сдержать ударную волну, которая серьезно испытала систему здравоохранения. 

После этого COVID-19 быстро пересек океан, и по состоянию на 20 июня 2020 года в США было зарегистрировано около 2282000 случаев (121000 смертей). Очень пострадала Бразилия, где зарегистрировано более 1000000 случаев и около 50000 смертей. 

Хотя со временем уровень летальности COVID-19 стал ниже, чем при эпидемиях SARS и MERS, зараженность SARS-CoV-2 намного выше, чем у предыдущих вирусов, с гораздо большим общим числом смертей. Было подсчитано, что примерно каждый пятый человек во всем мире подвергается повышенному риску тяжелого заболевания COVID-19 из-за основных заболеваний.

В разгар кризиса ученые решили использовать платформу Statpearls, представляющую собой инструмент, позволяющий делать обновления в режиме реального времени. Таким образом, цель состоит в том, чтобы собрать информацию и научные доказательства, а также предоставить обзор темы, который будет постоянно обновляться.

ВЫСОКИЕ ЗНАЧЕНИЯ CQ ДЕЛАЮТ РЕЗУЛЬТАТЫ ТЕСТА ЕЩЕ БОЛЕЕ БЕССМЫСЛЕННЫМИ

Другая важная проблема заключается в том, что многие тесты ПЦР имеют значение «количественной оценки цикла» (Cq) более 35 циклов, а некоторые, включая «тест Drosten PCR», даже имеют Cq 45.

Значение Cq указывает, сколько циклов репликации ДНК требуется для обнаружения реального сигнала от биологических образцов.

«Значения Cq выше 40 являются подозрительными из-за предполагаемой низкой эффективности и как правило, не должны сообщаться», — говорится в рекомендациях MIQE .

MIQE означает «Минимум информации для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени», набор руководящих принципов, которые описывают минимальную информацию, необходимую для оценки публикаций по ПЦР в реальном времени, также называемой количественной ПЦР или qPCR.

Сам изобретатель Кэри Муллис согласился,  :

Рекомендации MIQE были разработаны под эгидой Стивена А. Бустина, профессора молекулярной медицины, всемирно известного эксперта по количественной ПЦР и автора книги AZ по количественной ПЦР, которую назвали «библией  количественной ПЦР

Лабораторные исследования на COVID-19

Лабораторные тесты при грамотном назначении и расшифровке дают много полезной информации. В частности по лабораторным исследованиям:

• На ранней стадии заболевания может быть продемонстрировано нормальное или пониженное общее количество лейкоцитов (WBC) и пониженное количество лимфоцитов. Интересно, что лимфопения является негативным прогностическим фактором.
• Могут быть обнаружены повышенные значения ферментов печени, лактатдегидрогеназы (ЛДГ), мышечных ферментов и С-реактивного белка.
• Если бактерии не перекрываются, уровень прокальцитонина нормальный.
• Повышенное отношение нейтрофилов к лимфоцитам (NLR), производное отношение NLR (d-NLR) и отношение тромбоцитов к лимфоцитам могут быть выражением воспалительного процесса. Коррекция этих индексов является выражением благоприятной тенденции.
• Обнаруживается повышенный D-димер. 

У пациентов в критическом состоянии уровень D-димера увеличивается, лимфоциты крови постоянно уменьшаются, и обнаруживаются лабораторные изменения полиорганного дисбаланса (высокий уровень амилазы, нарушения свертывания крови и т. д.).

НЕРАЦИОНАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ТЕСТОВ

Также несомненно, что мы не можем узнать уровень ложноположительных результатов ПЦР-тестов без широко распространенного тестирования людей, у которых определенно нет вируса, подтвержденного этим методом, не зависящим от теста (имеющим твердый золотой стандарт).

Поэтому неудивительно, что существует несколько работ, иллюстрирующих иррациональные результаты тестов.

Например, уже в феврале орган здравоохранения китайской провинции Гуандун сообщил, что люди полностью выздоровели от болезни, виной которой является COVID-19, начали тестировать «отрицательный», а затем снова «положительный» .

Месяц спустя статья, опубликованная в Журнале медицинской вирусологии, показала, что 29 из 610 пациентов в больнице в Ухане имели от 3 до 6 результатов анализов, которые менялись между «отрицательными», «положительными» и «сомнительными» .

Третий пример — исследование из Сингапура, в котором тесты проводились почти ежедневно на 18 пациентах, и большинство из них переходило от «положительного» к «отрицательному» обратно к «положительному», по крайней мере, один раз и до пяти раз у одного пациента .

Даже Ван Чен, президент Китайской академии медицинских наук, признал в феврале, что тесты ПЦР «точны только на 30–50 процентов», в то время как Син Ханг Ли из Милфордской лаборатории молекулярной диагностики 22 марта 2020 г. отправил письмо группе реагирования на коронавирус ВОЗ и Энтони С. Фаучи, заявив, что:

Другими словами, даже если мы теоретически предположим, что эти ПЦР-тесты действительно могут обнаружить вирусную инфекцию, тесты будут практически бесполезными и вызовут только необоснованный страх среди «положительных» людей.

Все это согласуется с тем фактом, что CDC и FDA, например, признают в своих файлах, что так называемые «тесты SARS-CoV-2 RT-PCR» не подходят для диагностики SARS-CoV-2.

В «CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) в режиме реального времени RT-PCR Диагностическая панель» Файл от 30 марта 2020 года, к примеру, он говорит:

А также:

И FDA признает, что :

Достоинства и недостатки метода ПЦР

Современные методы позволяют точно подобрать набор веществ, нужных для реакции, а значит, «достроить» именно ДНК SARS-Cov-2, а не другого похожего.

Теперь о недостатках. Первое — относительно высокая цена. Она обусловлена высокой себестоимостью как праймеров, так и оборудования – амплификаторов. Второе — время. Ждать, пока размножится ДНК, нужно несколько часов, а с учетом транспортировки до лаборатории результаты теста пациент может узнать через сутки и более.

Также эффективность теста не превышает 80%. Праймеры для реакции подбираются на основе информации об РНК вируса. Но фрагмент с теми же «буквами» может оказаться и в других микроорганизмах пробы – отсюда ложноположительный результат. Ложноотрицательный результат получится, если вирусные частицы ушли из ротоглотки, спустились дальше по дыхательному пути. Тогда в пробе просто не окажется РНК вируса.

Сдавать тест ПЦР есть смысл в том случае, если человек контактировал с пациентом с подтвержденным коронавирусом.

Биомаркеры – неспецифическая диагностика

Биомаркеры – показатели, которые служат индикаторами состояния здоровья – необходимы для раннего выявления категорий людей с высоким риском тяжелого течения Covid-19. Наиболее часто используются общий и биохимический анализы крови, помогающие определить маркеры, коррелирующие с различными степенями тяжести протекания инфекции. Таким образом можно предотвратить осложнения и замедлить прогресс заболевания.

Значимые диагностические критерии коронавируса – это прокальцитонин, эозинопения, лимфопения, нейтрофилия.

Прокальцитонин

Прокальцитонин вырабатывается щитовидной железой, печенью и легкими. Его уровень значительно повышается при присоединении бактериальной инфекции. В норме значения прокальцитонина не превышают 0.05 нг/мл, при вирусном поражении они могут увеличиваться до 1 нг/мл или оставаться нормальными.

Воспалительный процесс сопровождается резким усилением выработки этого вещества, уровень которого всего за 6-12 часов может достичь 20-200 нг/мл, что требует проведения антибактериальной терапии.

Эозинопения

Уменьшение уровня эозинофилов в крови типично для зараженных Ковидом, но не зависит от характера его течения. Маркером оно может служить, если есть характерные внешние признаки инфекции и изменения в легких, которые видны на компьютерной томограмме или рентгеновских снимках.

Лимфопения

Снижение числа лимфоцитов наблюдается у большинства больных. Это клетки иммунитета, которых становится больше по мере распространения инфекции. Особенно сильная лимфопения развивается при тяжелом течении болезни с высоким риском летального исхода.

Нейтрофилия

Нейтрофилы – это разновидность лейкоцитов, повышение уровня которых тоже связано с тяжелым протеканием Covid-19 и обусловлено разрушением клеток легочной ткани. Они синтезируют так называемые нейтрофильные экстраклеточные ловушки (НЭЛ) с целью ликвидации вируса.

Цитокиновый шторм – это не поддающееся контролю воспаление, которое приводит к повреждению собственных клеток организма

Однако чрезмерная активность НЭЛ отягчает ход заболевания и способна привести к смерти, поскольку активация иммунных клеток влечет за собой цитокиновый шторм.

В организме продуцируется избыточное количество противовоспалительных цитокинов, которые запускают механизм гипериммунного воспаления легких. Кроме того, внеклеточные ловушки могут быть базой для образования тромбов

Вот почему так важно тормозить активность нейтрофилов